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临床测定技术的发展主要在于方法学的发展,预测了与spVL相关的一组核心抗原表位

1月15日,德国马普所科研人员在PNAS上发表了题为“HIV peptidome-wide
association study reveals patient-specific epitope repertoires
associated with HIV
control”的文章,通过HIV多肽组关联分析揭示了与HIV控制相关的患者特异性抗原表位序列,为HIV的精准治疗提供了新靶点。

核心提示:研究人员已经发现了一组遗传变异,这些遗传变异看来可以决定哪些人是否会成为HIV“控制者”。HIV控制者指的是那些罕见的人:他们身上有着高浓度的HIV但却不会发展成艾滋病,他们也不需要服药。
这些遗传变异一共有300多个,它们会影响人的免疫系统通过所谓的HLA蛋白来识别HIV-感染细胞的方式,HLA蛋白会把该病毒的片段呈现在细胞的表面。

核心提示:ELISA试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广ELISA试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广泛应用在免疫学检验的各领域中。然而,影响ELISA试验结果的因素很多,故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。一、ELISA试剂盒测定技术的发展bwin必赢体育在线 ,临床测定技术的发展主要在于方法学的发展,而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前,分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识,其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的,它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举,并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。1、基因工程试剂对免疫测定技术
发展的影响
免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应,所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料,如抗原抗体,酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原,而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体,而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来,随着分子生物学的发展,使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂,各种新型使用的测定方法也不断出现。HBsAg试剂特点(检测模式:临
床抗体夹心法):包被抗体为山羊多抗,多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位。可测得HBsAg变异样品。提高检测的特异性提高检测的灵敏度,应用Parl
Ehrich
学说HBsAg标准品,对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml2、基因工程较早用于免疫测定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,这两种基因工程抗原的出现,较好地解决了抗HBc和HBe的测定问题。因为要从病毒本身去大量获取这两种纯抗原较为困难,并且这一点对于难培养的病原微生物来说,如HIV、HCV和梅毒螺旋体等都有些共性。2.1
HCV-ELISA试剂HCV目前尚不能体外培养,只能用基因工程或化学合成方法获取HCV结构和非结构区的各种抗原片断,已知HCV基因组有7个功能区组成:核心、E1、E2/NS1
NS2 NS3 NS4
NS5区,合成抗原的优点是易于纯化,特异性好,抗原抗体反应强。2.1.1第一代抗HCV-ELISA试剂盒:-由美国ortho公司克隆C1003抗原几个片断与人超氧化物歧化酶结合。用酵母从病毒基因组非结合区得到表达,表达为融合蛋白,亦作为包被固相载体。-抗原组合:NS4
区二个基因片断为NS
5-1-1和C1003-特性:IgG抗C100在发病后数月后,才检出,故不宜作早期诊断。-约由20%的病人不出现抗体。IgM抗-C100急性期检出率只有64%。-C100的抗原性较弱,在HCV复制中,不能充分暴露宿主的免疫系统。-特异性和灵敏性较差。2.1.2第二代HCV-ELISA试剂盒-用基因重组的HCV结构蛋白与非结构蛋白抗原包被固相载体。-抗原组合:核心区多肽C22
NS区多肽C33 C1003和NS
5-1-1-增加C22区和C33区后,抗体出现早,有助早期诊断,提高阳性率。有利早期诊断。-C22是早期易出现病毒血症2.1.3第三代HCV-ELISA试剂盒人工合成多肽抗原,由36个氨基酸组成的Cp9和19个氨基酸组成Cp10混合包被固相载体。抗原组合:除有C
100-3 C22 C33 外又增加了core 和NS3 NS4 NS5特点: *core NS3
NS5由Baculovirus 重组表达,没有非特异性的 载体,试剂特异性高
,重组的蛋白经融合形成大分子抗原,利于提高检测灵敏度。 * NS3
区增加了氨基酸片断。改进了反映的灵敏度。 * NS5
经优化,徐去了非特异性的区域NS3
NS5是血转化最早测得的抗体,提高了诊断的准确性。 * NS4
为俩个片断的合成多肽,去掉了非特异性反应的区域,加强了试剂的灵敏度和特异性。2.1.4第四代HCV—ELISA
试剂盒-美国新近推出一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白,称为多决定基融合抗原,采用表面活性剂处理分界病毒表面复合物,释放HCV核心抗原并用ELISA法,灵敏度可达500拷贝/ml,已接近核酸扩增检测水平。-抗原组合:以Core和NS3作为主要检测片断加合成多肽NS4-特点:直接测Core抗原
不易发生变异 抗IgM 和IgG检出率可达100%
特异性达99.8%灵敏度为100%3、基因工程抗体及其功能试剂80年代后人们开始使用基因工程技术制备抗体,并进而将抗体分子片断与其它蛋白融合得到多功能试剂,到目前为止,基因工程抗体在免疫测定上的应用尚处于一个初级阶段。且主要是将抗体与其它蛋白以融合蛋白形式表达而得到多功能试剂,如澳大利亚学者应用基因工程技术制备了抗人红细胞抗体与HIV-1gpN41的融合蛋白。这种重组蛋白,即基因工程双功能试剂,在此基础上,建立了快速,灵敏和特异的自身红细胞凝集试验.3.1
HIV-ELISA抗原/抗体试剂1998年,美国首先研制第四代试剂,对检测HIV的同时检测P24抗原,故称HIV抗原/抗体试剂,国内已有引进.抗原组成:gp160gp36gp170和单克隆抗p24抗体包被.3.1.2P24抗原测定采用夹心法ELISA,即将将纯化的已知抗体包被,当加入带测血清后,若血清中含有P24与包被抗体形成抗原抗体复合物,再加入酶标记HIV抗体。在抗原上又结合了酶标记的抗体,加底物
显色后在酶标仪上读结果。近来为提高检测血清中P24抗原的敏感性,将血清中免疫复合物解离后再进行测定。发展了
P24抗原测定技术。3.1.3抗HIV-ELISA试剂目前对HIV的检测原料有了较大改进,主要如下:可用于检测血清或血浆中HIV
IgM亚特异性抗体和检测HIV-1、2和多种亚型。标记的抗原:
a.含HIV-1B亚型gp41和P24的HIV-1重组融合蛋白。
b.可特异性检测血清或血浆中HIV
M群的抗体,绝大多数HIV-1.0群和HIV-2群的抗体。
c.gp36免疫调控区的HIV-2多肽可测定特异性的HIV-2抗体。 d.gp41的俩段HIV
1.0群多肽,可测特异性HIV 1.0 群的抗体 和HIV
1M群的抗体。从以上抗原设计保证HIV的来自不同亚型/或区域的抗原亚型抗体的检测。减少了变异株的漏检。HIV-1.0.2对759份各类临床样品包括401份HIV-1感染不同阶段病人样品,204分HIV-2感染不同阶段病人样品,和154份与HIV无关的其他疾病患者的样品的检测结果。特异性:99.93%
灵敏度:100%对欧洲血液中心的8842份常规鲜血者样品用HIV-1.0.2进行评价筛选,并经确认实验获得的结果。3.1.4
HIV 确认试剂—免疫印记试剂判断标准我国 HIV
抗体阳性:至少二条膜带(即gp160/gp120)或至少一条膜带和p24带同时出现美国
HIV-1阳性(任何两个中有二条带(P24 gp41 gp120/gp160), HIV-2无阳性WHO :
HIV -1 阳性(不管有无核心带或酶带, 但有两条膜带)
HIV-2阳性(不管有无核心带或酶带,单有两条膜带即为阳性)4、
基因工程酶及其融合蛋白
除了基因工程抗原、抗体外,与标记免疫测定有关的另一中重要的基因工程试剂就是酶及其融合蛋白,以重组酶建立免疫测定方法较为成功的是CEDIATM均相酶免疫试验。使用基因工程酶技术生产免疫测定标记酶,是得到符合标记要求的高纯度酶的一条新途径,但如以其他蛋白融合的方法,不但避免了繁琐且低效率的酶与蛋白的化学交联,而且无需得到纯化的酶和抗原或抗体。随着分子生物学技术的发展,将有越来越多的酶免疫测定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基础之上。发展趋势如下:1)、由单一病原蛋白向多决定簇融合蛋白转变,并尽可能包括病原体基因组功能区的所有的能引起肌体免疫应答的决定簇。2)、表达的抗原将尽可能少含有非特异性抗原
或共同抗原。3)、为某一目的如病原体基因型确定而设计表达特定的多肽抗原片断。总之,将围绕改善免疫测定的特异性和敏感性来制备基因工程片断。
二、
试剂盒的方法学设计
目前,ELISA的测定模式,主要有双抗体夹心法测定抗原,如
HBsAg,HBeAg,AFP,HCG等;间接法测定抗体如HCV ,抗HIV
等;双抗体夹心法测抗体如HBs,竞争法测抗体,如HBe,抗HBc等;竞争法测抗原,如激素等小分子。固相捕获法测IgM抗体等,这里只简述双抗夹心法测抗原。目前有一步法和二步法之分。1、HBsAg-ELISA法:?1.1
一步法:在加入待测物的同时加入酶结合物一起温育,一步即完成反应过程,一步法ELISA的反应曲线为钟型曲线,也就是说测定随着待测物中抗原浓度的增加而升高至一定后,测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色,即所谓的“钩状效应”,也就是我们在免疫沉淀实验中所称的“带现象”。一步法的反应平衡式如下:?
Ab+Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*+Ab·Ag+Ag·Ab*+Ab*·Ag·Ab*?
?其中a为最后测定结果的显色源,当待测物中Ag浓度增加时,无疑会使b,c,和d复合物增加,从而消耗有限的Ab*,使a复合物相应减少,显色降低,吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟型曲线,而且由于d复合物的形成,使得在同样的Ab*浓度下,一步显色较二步法为浅。?目前一步法所出现“钩状效应”,现已有进展,即采用包被为一种抗体,酶标记用空间距离较远的决定簇的抗体,同时在操作中充分混匀反应液,并适当延长温育时间,则可使b,c和d复合物减少到最低程度,而不出现“钩状效应”图1
一步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线二步法:随着待测物中抗原浓度的逐步增加,将使固相抗体与抗原的结合逐步达到饱和,这样在一定浓度Ab*的存在下,Ab·Ag复合物的形成将直接与Ab*结合,抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深,而形成S形变化曲线:?
Ab+Ag→Ab·Ag ? Ab·Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*
?综上所述,一步法ELISA试剂盒作为适合临床实验室简便快速要求的产物,有着巨大市场,其虽有潜在缺陷,易导致高浓度待测物的标本检测为假阴性,但精心的实验设计,对包被和酶标记抗体的仔细选择,完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。图2
二步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线56net亚洲必嬴mg 1

高度多态性HLA
I类分子抗原肽结合沟槽的遗传变异与HIV-1控制和向艾滋病的进展有关联,此类变异占到HIV-1调定点病毒载量(set
point viral load,
spVL)变异的12%。这表明HLA将HIV-1抗原表位递呈给T细胞在疾病控制中起着重要作用,但是HIV抗原表位与相应HLA的结合机制不是十分明确。在本研究中,科研人员开发了一种多肽组关联分析(peptidome-wide
association study,
PepWAS)方法,整合了6311名HIV感染患者的HLA基因型和spVL数据,以筛选整个HIV-1蛋白质组(3252个特异肽)中与疾病相关的肽。通过PepWAS法,预测了与spVL相关的一组核心抗原表位,包括已知的抗原表位以及几个先前未明确的疾病相关肽。更重要的是,每个患者通过各自的HLA-A和HLA-B变异体仅呈现出这些预测的核心表位的一小部分。这些患者特异的抗原表位的个体差异导致了spVL的变化。PepWAS法的应用全面揭示了HLA和HIV-1控制之间的紧密联系,为AIDS靶向治疗提供了可优先考虑的抗原表位。(摘译自PNAS,
Published: 15 January 2019)

研究人员已经发现了一组遗传变异,这些遗传变异看来可以决定哪些人是否会成为HIV“控制者”。HIV控制者指的是那些罕见的人:他们身上有着高浓度的HIV但却不会发展成艾滋病,他们也不需要服药。
这些遗传变异一共有300多个,它们会影响人的免疫系统通过所谓的HLA蛋白来识别HIV-感染细胞的方式,HLA蛋白会把该病毒的片段呈现在细胞的表面。

次数

大约每300个感染HIV的人中会有一位是HIV控制者。研究人员希望通过了解这些控制者是如何抑制该病毒的复制过程的,这样他们可能会发现研发某种疫苗或其它治疗方法的新线索。Florencia
Pereyra及其一个大型的研究团队对参加国际HIV控制者研究的患者开展了一个在整个基因组范围内的关联分析。一个基因组范围内的关联研究是将不同个体的基因组进行比较以寻找某个人与另一个人之间的与疾病或其它特性有关联的差别。研究人员将欧洲人、非洲裔美国人及西语裔的后裔中的HIV控制者与HIV的进展者进行了比较。他们发现了300多个具有基因组范围内意义的变异体。所有这些变异体都位于第6条染色体的某个区域,而该区域正是HLA基因所在的地方。他们接着分析了位于HLA蛋白内的个体氨基酸的功效,他们发现了6个独立的有意义的残基,其中有5个残基是顺着与病毒颗粒结合的肽的沟槽排列的。
尽管人们必需要做更多的研究来弄清这些差异究竟是如何造成对HIV的控制力的,但这些发现表明,该过程是以病毒肽抗原结合HLA蛋白的方式开始的,而这一结合接着影响了可识别和摧毁感染细胞的T细胞的激活。

质控血清1

亚洲必赢网址bwin ,关键字:HIV 控制者 遗传 基因

阴性对照品

Cut-off值

S/CO值

A值

A值

阴性A值X2.1

1

0.180

0.050

0.105

1.71

2

0.190

0.050

0.105

181

3

0.180

0.050

0.105

亚洲必赢36net手机入口 ,1.71

4

0.185

0.050

0.105

1.76

5

0.195

0.050

0.105

1.86

6

0.205

0.050

0.105

1.95

7

0.215

0.050

0.105

2.05

8

0.170

0.050

0.105

1.62

9

0.473

0.050

0.210

2.25

10

0.140

0.050

0.105

1.33

11

0.215

0.050

0.105

2.05

12

56net亚洲必嬴mg ,0.205

0.050

0.105

1.95

13

0.180

0.050

0.105

1.71

14

0.170

0.050

0.105

1.62

15

0.116

0.050

0.105

1.10

16

0.185

0.050

0.102

1.76

17

0.205

0.050

0.105

1.958

18

0.170

0.050

0.105

必赢亚洲626.net ,1.62

19

0.190

0.050

0.105

1.81

20

0.200

0.050

0.105

1.90

通过表2.1,计算20各质控血清的s/co值的均值和变异系数:X=1.78 s=0.25
cv=14.3%从而获得该实验室OCV测定数据。2、常规条件下已知值质控血清变异做常规检验的技术人员,在常规检验的条件下,将质控血清放在常规检测样本中,进行20次检验,结果计算同OCV法。仍以HBsAg为例,检测2ng/ml的质控血清,结果和计算见表2.2

次数

质控血清1

阴性对照品

bwin线上娱乐 ,Cut-off值

S/CO值

A值

A值

阴性A值X2.1

1

0.250

0.050

0.105

2.38

2

0.180

0.050

0.105

1.71

3

0.290

0.050

0.105

2.76

4

0.310

0.050

0.105

2.95

5

0.160

0.070

0.147

1.09

6

0.150

0.080

0.168

0.89

7

0.270

0.050

0.105

2.57

8

0.400

0.100

0.210

1.90

9

0.270

0.120

0.252

1.07

10

0.100

0.090

0.189

0.53

11

0.353

0.050

0.105

3.36

12

0.160

0.070

0.147

1.09

13

0.110

0.040

0.084

1.31

14

0.120

0.030

0.063

1.90

15

0.270

0.120

0.252

1.07

16

0.350

0.110

0.231

1.52

17

0.220

0.090

0.189

1.16

18

0.370

0.100

0.210

0.33

19

0.500

0.150

0.315

1.59

20

0.410

0.090

0.189

2.17

通过表2.2,计算20各质控血清的s/co值的均值和变异系数:X=1.67 s=0.82
cv=49.1%这组数据中的s值变异太大,s值为0.82已经3倍于ocv的s
0.25,不予接受。

一般 RCV的S值在OCV 的
S值的两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因,使其向ocv
的s值靠近。在改进实验条件后(例如校正加样器,纠正洗板操作,调整温育温度等),重新进行RCVK的测定结果.

其结果见标2.3

次数

质控血清1

阴性对照品

Cut-off值

S/CO值

A值

A值

阴性A值X2.1

1

0.180

0.050

0.105

1.71

2

1.190

0.050

0.105

1.81

3

0.200

0.050

0.105

1.90

4

0.228

0.060

0.126

1.81

5

0.137

0.060

0.126

1.09

6

0.221

0.050

0.105

2.10

7

0.150

0.050

0.105

1.43

8

0.170

0.050

0.105

1.62

9

0.180

0.040

0.084

2.14

10

0.150

0.050

0.105

1.43

11

0.200

0.050

0.105

1.90

12

0.142

0.050

0.105

1.35

13

0.210

0.050

0.105

2.00

14

0.221

0.050

0.105

1.52

15

0.180

0.050

0.105

1.71

16

0.190

0.050

0.105

1.81

17

0.160

0.050

0.105

1.52

18

0.221

0.050

0.105

2.10

19

0.210

0.050

0.105

2.00

20

0.150

0.050

0.105

4.13

通过表2.3,计算20各质控血清的s/co值的均值和变异系数:X=1.72 s=0.29
cv=16.9%这组数据中的s值变异太大,s值为0.29有明显改善,已经接近ocv的s
0.25。符合要求。如果RCVK的值比OCV的S
值更小,说明OCV不是最佳条件下测定的,应重新测定OCV。3、常规条件下未知值质控血清变异的测定有时为了避免主观性,再做RCVU测定。测定步骤同RCVK,但测定的操作者不知质控血清的定值;或在操作者不知道哪一份是质控血清的条件下进行常规检验,以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。4、质控图

次数

质控血清1

阴性对照品

Cut-off值

S/CO值

A值

A值

阴性A值X2.1

21

7.4

0.160

0.050

0.105

1.52

22

7.7

0.1900

0.050

0.105

1.81

23

7.8

0.200

0.050

0.105

1.90

24

7.11

0.228

0.060

0.126

1081

25

7.12

0.139

0.050

0.126

1.10

26

7.15

0.221

0.050

0.105

2.10

27

7.16

0.150

0.050

0.105

1.43

28

7.18

0.170

0.050

0.105

1.62

29

7.19

0.225

0.050

0.105

2.14

室内质控图示例56net亚洲必嬴mg 2

次数

s/co值

次数

s/co值

1

1.71

12

1.35

2

1.81

13

2.00

3

1.90

14

1.52

4

1.81

15

1.71

5

1.09

16

1.81

6

2.10

17

1.52

7

1.43

18

2.10

8

1.62

19

2.00

9

2.14

20

1.43

10

1.43

21

1.52

11

1.90

56net亚洲必嬴mg 3

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