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技术)无法将染色质关闭状态和未检测到的情况区分开,DNA错误复制会使基因组不稳定

近日,康奈尔大学医学院等科研人员在Nature上以报道形式发表了题为“Female-biased
embryonic death from inflammation induced by genomic
instability”的文章,发现在小鼠中,DNA错误复制会使基因组不稳定,并引发胎盘炎症,更易导致雌性胚胎死亡。

2017 年 6 月 16
日,北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心汤富酬课题组在《Cell
Research》杂志在线发表了题为 “Single-cell multi-omics sequencing of
mouse early embryos and embryonic stem cells”
的研究论文。在国际上率先发展了对一个单细胞同时进行染色质状态、DNA
甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性的全基因组测序技术,并采用这一技术在单细胞分辨率上系统、深入地解析了小鼠着床前胚胎发育过程中表观基因组重编程的关键特征,以及染色质状态与
DNA 甲基化之间的互动关系。

2018年6月18日,北京大学第三医院乔杰院士研究团队和北京大学生命科学学院汤富酬研究员研究团队合作,在《自然细胞生物学》(Nature
Cell
Biology
,IF=20.06)杂志在线发表人类植入前胚胎多组学研究新进展——“人类早期胚胎的单细胞多组学测序”(Single-cell
Multi-omics Sequencing of Human Early
Embryos)。该研究利用国际领先的单细胞COOL-seq技术,首次在单细胞水平绘制了人类植入前胚胎发育过程中的全基因组DNA甲基化和染色质状态图谱,进一步解析了胚胎发育阶段复杂而协调的表观遗传重编程过程。

基因组不稳定性可以触发各种细胞反应,包括检查点活化、衰老和炎症。虽然在细胞培养和癌症病例中,针对基因组不稳定性已经进行了广泛研究,但它对胚胎发育的影响却知之甚少。微小染色体维持复合体是由MCM2至MCM7等6个蛋白形成的异六聚体,在DNA复制中具有解旋酶活性。研究人员发现,该复合体上的突变会导致基因组不稳定,使小鼠雌性胚胎明显比雄性胚胎更容易受到致死性的影响。

现有的基于高通量测序来分析全基因组染色质状态的研究方法通常需要大量细胞(例如
ATAC-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq
等)。即使这些方法可以做到单细胞分辨率,也无法对同一个单细胞的各个表观基因组层面同时进行分析,因而无法在单细胞分辨率上对多种组学之间的互动关系进行研究。而汤富酬课题组将
NOMe-seq(全基因组核小体定位及 DNA 甲基化组测序)技术和 PBAT-seq
技术巧妙地结合起来,并进行了系统的优化和提高,实现了对同一个单细胞进行多达
5 个层面(染色质状态、核小体定位、DNA
甲基化、基因组拷贝数变异和染色体倍性)的基因组和表观基因组特征的分析。

北医三院乔杰团队与北京大学汤富酬团队长期密切合作,致力于揭示人类发育过程中基因表达与表观遗传学调控机制,绘制了完整的人类着床前胚胎的高精度单细胞转录组图谱(Nature
Structural & Molecular Biology
,
2013),对人类早期胚胎及原始生殖细胞发育过程中DNA甲基化组重编程进行了系统研究(Nature,2014;Cell,2015),为深入理解人类胚胎发育及配子发生过程中的分子机制提供了重要依据。2018年1月,合作团队对人类植入前胚胎发育过程进行了更加深入的分析,揭示了人类早期胚胎DNA去甲基化和从头加甲基化的动态变化及父母源基因组差异甲基化等关键特征(Nature
Genetics
, 2018)。

该性别偏好性致死现象不是由X与Y染色体大小、X染色体失活缺陷或差异复制引起,而是由于雌性胚胎无法产生睾酮导致,而外源性或内源性睾酮保护胚胎的能力与其抗炎的特性有关。FANCM胚胎突变体与MCM胚胎突变体类似,二者的基因组不稳定性水平(以具有微核的细胞数量来衡量)都相对较高。布洛芬是一种非甾体类抗炎药,可使Mcm和Fancm基因突变的雌性胚胎避免死亡。此外,缺乏抗炎因子IL10的受体对Mcm4Chaos3解旋酶突变体具有致死作用。

图 1: single-cell COOL-seq 原理图

本研究旨在进一步揭示染色质状态在DNA甲基化重编程过程中的动态重构过程、亲本特异的染色质状态以及多组学之间的关系。通过运用单细胞多组学测序技术(single-cell
COOL-seq),区分出整倍体和非整倍体细胞,利用整倍体胚胎的单细胞数据,系统描绘了人类植入前胚胎发育过程中多个关键阶段表观基因组多个层面的动态变化。

该研究表明,在胚胎发育过程中,因DNA复制相关损伤诱导的炎症,对雌性胚胎具有偏好性致死作用;而雄性胚胎受高水平内在睾酮的保护,可以避免胚胎死亡。该研究阐明了基因组不稳定诱发炎症的机制,为相关肿瘤的免疫治疗提供潜在的新靶点。(摘译自Nature,
Published: 20 February 2019)

除了可以在单细胞水平上同时对多种组学进行分析,与现有的分析染色质状态的单细胞测序技术相比,scCOOL-seq
技术还具有如下优点:

该项研究的主要发现包括以下几方面:

对于基因组中核心的功能元件区域具有很高的灵敏度和覆盖度。例如,对于小鼠胚胎干细胞系的一个单细胞,可以同时检测到
18,000 多个基因的启动子区域的染色质状态以及 DNA 甲基化水平,
也可以同时检测到 11,000 多个 CpG 岛的染色质状态以及 DNA
甲基化水平;这为分析干细胞分化发育过程中染色质状态的异质性以及 DNA
甲基化水平的异质性提供了强大的工具。

(1)在受精后19小时内,来自精子的父源基因组和来自卵母细胞的母源基因组都进行了大规模的染色质重构,父源基因组染色质被迅速打开,而母源基因组染色质的开放程度降低。随后染色质开放程度同时回落,到8-细胞期胚胎合子基因组激活后再次增加,桑椹胚时期达到最高点(图1)。与小鼠相似,人类胚胎中近端染色质开放区域具有强烈的发育阶段特异性,更重要的是近端染色质开放区域在合子基因激活时期,即4-细胞到8-细胞时期,发生了最剧烈的染色质重构过程。

可以精准地鉴定出染色质的开放状态和关闭状态,准确地把染色质关闭状态与由于技术原因未检测到的情况区分开来。现有的其他单细胞染色质状态测序技术(例如
scATAC-seq 和 scDNase-seq
技术)无法将染色质关闭状态和未检测到的情况区分开,这一缺点在现有技术的灵敏度比较低的情况下尤为严重。而
scCOOL-seq 技术可以准确地区分染色质关闭状态(检测到了该基因组 DNA
片段,但是其中的 GpC
位点没有被甲基化)和由于技术原因未检测到的情况。这样对一种细胞类型中不同的单个细胞之间同一个基因组区域的染色质开放状态和关闭状态之间的比例可以给出精确的测量结果,而不受检测灵敏度波动的影响。

图片 1

可以对同一个 DNA 单分子同时获得其染色质状态和 DNA
甲基化的信息,使得这一技术不但具有单细胞分辨率,甚至达到了单分子分辨率,可以对同一个二倍体细胞的两个等位基因分别进行染色质状态和
DNA 甲基化的分析。

图1 人类植入前胚胎发育过程中染色质开放程度的动态变化

由于该方法同时扩增和测序开放的和关闭的染色质区域,因而不受细胞中线粒体
DNA 含量波动的影响。在细胞中线粒体 DNA 通常是环形裸露的
DNA,一般处于开放状态。现有的其他单细胞染色质状态测序技术(例如
scATAC-seq 和 scDNase-seq
技术)由于只扩增和测序开放的染色质区域,因而极大地受细胞中线粒体 DNA
含量的影响,特别是在着床前的早期胚胎细胞中线粒体 DNA
的含量是普通细胞的数十倍甚至数百倍,因而对于 scATAC-seq 和 scDNase-seq
等技术造成严重影响。而 scCOOL-seq
技术由于同时扩增和测序开放的和关闭的染色质区域而不受这一问题的影响。

(2)研究发现,与小鼠不同,人类卵母细胞受精后,父源基因组的染色质迅速开放,开放程度迅速超过母源基因组,这种开放程度的不对称状态一直持续到4-细胞阶段(图2)。这可能更有利于DNA去甲基化酶在父源基因组上的结合,从而加速父源基因组的去甲基化进程以及其它表观遗传学重编程进程。而小鼠胚胎在受精后每个胚胎细胞中父源与母源基因组染色质的开放程度相似,并且一直维持这种对称状态。

由于掺入了 10% – 20% 的外源 lambda
DNA,所以可以准确判断所分析单个细胞所处的细胞周期阶段以及染色体倍性。这对于准确分析染色质状态和
DNA 甲基化与细胞周期以及染色体倍性的关系非常有帮助。

图片 2

考虑到多组学的信息量、有效数据量带来的高昂测序成本等问题,对于细胞数量少,异质性强的着床前胚胎发育过程的研究,scCOOL-seq
方法非常适合。该方法可以更好地覆盖全基因组,有效地解决了目前 scATAC-seq
研究中线粒体片段过度富集导致的有效数据量过少的问题。同时,该方法可以同时分析单个细胞中染色质开放程度、核小体定位、DNA
甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性这 5
个组学层面,对于难以大量获得的哺乳动物早期胚胎的发育、以及复杂的癌症等疾病研究,都将提供全面有效的解决方案。

图2
人类植入前胚胎发育过程中父母源基因组DNA甲基化与染色质开放程度的不对称分布

在此基础上,该课题组利用这一新建立的 scCOOL-seq
方法,在单细胞分辨率系统地描绘了小鼠着床前胚胎发育过程中表观基因组多个层面的动态变化。高度特化的精子和卵细胞结合后,会进行一系列复杂、精确的染色质重塑过程,从而建立起早期胚胎发育的全能性和多能性。对该过程的解析将有利于人们理解细胞多能性建立过程中的表观遗传调控机制以及胚胎发育异常的分子机理,该项研究发现:

(3)该研究实现了对人类与小鼠着床前胚胎父母源基因组染色质开放程度的系统定量比较(图3)。与小鼠胚胎相比,人类着床前胚胎具有更开放松散的染色质结构,而这一松散的染色质结构有可能更容易出现基因组不稳定性,进而导致人类着床前胚胎发育阻滞比例较高、囊胚率低于小鼠(人类胚胎的囊胚发育率只有40-60%,而小鼠胚胎的囊胚发育率高达95%以上)。人类和小鼠染色质状态重构模式的差异刚好与这两个物种合子基因激活时间的差异吻合。

受精后 12
小时以内,来自高度特化的卵细胞和精子的雌雄原核就经历了大规模的基因组去甲基化,父源基因组
DNA 甲基化程度从精子中的 80%降低到雄原核中的 38%;同时母源基因组 DNA
甲基化程度从卵细胞中的 32% 降低到雌原核中的
28%。在此过程中,父母源基因组的染色体状态迅速打开,在受精卵的原核期就已经达到高度开放的状态,随后在受精卵晚期染色质开放程度大幅度回落,并在
2 – 细胞阶段之后开放程度再次逐步增加,到囊胚期时达到最高点。

图片 3

图 2:小鼠着床前胚胎发育过程中基因组内源 DNA
甲基化以及染色质状态异质性(基因启动子区域;Homogeneously
open、Divergent、Homogeneously closed
三种异质性状态)首次在单细胞分辨率系统分析了小鼠着床前胚胎发育过程中染色质状态的异质性。根据每个基因启动子区域在同一个发育阶段不同单细胞之间染色质状态的异质性,将小鼠的基因划分成均匀开放、开放
/ 关闭混合态、均匀关闭这三种状态。该研究发现在受精后 12
个小时以内受精卵中大部分基因的启动子区域就由均匀关闭状态迅速重编程为均匀开放状态,为合子基因在随后的转录做好准备通过
RNA
聚合酶抑制剂抑制转录的实验,首次在单细胞分辨率证明持续转录对于维持基因启动子区域的染色质开放状态具有重要作用。从受精前的卵细胞到受精后的晚期受精卵时期,启动子区大片段染色质开放区域的数量大幅度增加。该研究发现,使用
RNA 聚合酶抑制剂α-Amanitin
处理受精卵、抑制其转录活动,会导致数千个基因的启动子区大片段染色质开放区域重新关闭,说明持续的转录对于维持早期胚胎中大部分基因的启动子处于开放状态是必需的,染色质状态开放和转录活动互相促进,共同维持合子基因的稳定表达发现多能性核心因子
Oct4 的靶基因结合位点在 4 –
细胞阶段就已经打开并处于开放状态,远早于真正建立多能性的囊胚期,暗示这些位点作为潜在的顺式调控元件可能参与了早期胚胎细胞的命运决定过程。

图3 人鼠物种间父母源基因组染色质开放程度的比较

首次在单个细胞内对父母源基因组的染色质状态以及 DNA
甲基化进行了深入分析。从受精卵晚期到 4
细胞胚胎时期,在基因间区父源基因组甲基化要明显高于母源基因组;而在基因区,父源基因组甲基化要显着低于母源基因组。这是由于在基因间区,父源基因组的去甲基化速度较慢;而在基因区,父源基因组的去甲基化速度要远快于母源基因组的去甲基化速度。更重要的是,对于基因区,胚胎期表达水平越高的基因其父母源基因组
DNA
甲基化的不对称性越强烈(表达水平越高,母源基因组甲基化就比父源基因组高越多)。与此相反,受精后父母源基因组的染色质状态就迅速同步打开,到受精后
12
小时,父母源基因组的染色质状态在每个单细胞中就已经达到相同的开放状态,并在整个植入前时期维持这一父母源基因组之间染色质状态的精确平衡。这说明受精后,染色质状态和
DNA
甲基化进行了不同步的重编程过程,由于染色质状态对于合子基因的激活可能更重要,所以受精后父母源基因组的染色质状态快速重编程、在每个单细胞中迅速达到精确平衡并一直维持。而
DNA
甲基化的重编程要慢一些并在父母源基因组之间维持不对称分布:在基因间区,父源基因组甲基化高于母源基因组;而在基因区,父源基因组甲基化低于母源基因组,并且与胚胎期基因表达水平相关。

(4)每个雌性细胞中有两条X染色体,其中一条来自精子(父源X染色体),另外一条来自卵细胞(母源X染色体)。本研究发现在人类女性胚胎中,受精后父源X染色体迅速去甲基化并激活,到2-细胞期远低于母源X染色体的DNA甲基化水平,之后维持这一不平衡状态。同时,从受精卵到4-细胞期,父源X染色体的染色质状态比母源的更开放(图4)。

图 4:小鼠着床前胚胎发育过程中父母源基因组 DNA 甲基化的不对称分布

图片 4

首次在单细胞分辨率解析了雌性胚胎细胞中父母源 X 染色体的 DNA
甲基化和染色质状态重编程过程的异同。从配子到原核期受精卵,父源 X
染色体的 DNA 去甲基化速度明显比常染色体慢,而母源 X 染色体的 DNA
去甲基化速度和常染色体相当。从受精卵晚期到 4 细胞胚胎时期,父源 X
染色体的 DNA 甲基化明显高于母源 X 染色体,直到囊胚期,父母源 X 染色体的
DNA 甲基化水平才达到一致。这说明受精之后,在雌性胚胎中失活的父源 X
染色体其 DNA 甲基化重编程速度要明显慢于活跃的母源 X 染色体。二者之间 DNA
甲基化的差异一直到囊胚晚期才逐渐消除。受精后,雌性胚胎中父母源 X
染色体同步进行快速的染色质状态重编程,并在整个植入前时期维持这一父母源 X
染色体之间染色质状态的精确平衡。。

图4 单个女性胚胎细胞中父母源DNA甲基化与染色质开放程度的差异

图 5:小鼠着床前雌性胚胎单个细胞中父母源 X 染色体的 DNA
甲基化和染色质状态的动态变化

(5)研究首次发现,在人类胚胎植入前发育时期,DNA去甲基化和染色质重构在不同的基因组元件是不同步的。受精后表现出高度DNA甲基化异质性的基因,和表现出高度染色质状态异质性的基因是不同的两类。

首次在单细胞分辨率揭示了小鼠植入前胚胎发育过程中表观基因组的异质性。受精后,基因组中大部分基因的启动子区域在同一种细胞的不同单个细胞之间维持着均匀的
DNA 甲基化和均匀的染色质开放状态。部分基因启动子区域的 DNA
甲基化或染色质状态在同一个阶段胚胎内不同单个细胞之间具有强烈的异质性。然而,启动子区域
DNA
甲基化异质性强烈的基因和染色质状态异质性强烈的基因分别是两类不同的基因。这暗示在小鼠着床前胚胎发育的过程中,染色质状态异质性和
DNA 甲基化异质性可能分别受不同机制的调控。

(6)利用转录抑制试验,研究发现持续转录作为反馈机制,对于大量基因维持其启动子区域染色质持续处于开放状态具有重要作用。与对照组相比,经转录抑制的受精卵在8-细胞期有1700多个(35%)基因失去启动子区的染色质开放状态。

首次在单细胞分辨率将细胞周期与染色质状态联系了起来。研究人员在每个单细胞文库中加入了等量的
lambda DNA,通过基因组测序读数和 lambda DNA
测序读数之间的比例准确推断出每个单细胞的倍性和细胞周期阶段。该研究利用小鼠胚胎干细胞研究中已有的染色质优先复制和后续复制区域作为参照,发现这些区域在小鼠着床前胚胎发育过程中复制先后顺序和胚胎干细胞中一致,说明小鼠着床前胚胎在体内发育过程中和胚胎干细胞使用了基本相同的一组
DNA 复制起始位点。

(7)该研究结合染色质开放程度和DNA甲基化信息,进行了人类和小鼠的候选增强子预测,得到人类着床前胚胎的37000多个候选增强子区域。发现对于人类和小鼠着床前胚胎中的染色质处于开放状态的候选增强子,只有700多个是在这两个物种中同时处于染色质开放状态,说明在着床前胚胎发育过程中处于活跃状态的增强子具有很强的物种特异性。与此同时,该研究对人类着床前胚胎中鉴定出的接近40万个染色质开放区域(NDR)进行了转录因子结合富集分析,发现相对于滋养外胚层细胞,多能性的内细胞团中的远端(距离基因转录起始位点2kb以外)染色质开放区域更富集转录因子ZNF281的结合序列;而相对于内细胞团,滋养外胚层细胞中的远端染色质开放区域更富集转录因子CDX2、TFAP2C(AP2γ)的结合序列,这为今后研究人类着床前胚胎发育过程中转录因子调控下游基因表达奠定了基础。

图 6: 小鼠着床前胚胎 DNA 甲基化和染色质重塑特征示意图

本研究利用单细胞多组学高通量测序技术,系统分析了整倍体人类植入前胚胎的DNA甲基化重编程及伴随的染色质状态重构,加深了对人类胚胎表观遗传重编程过程的理解。研究首次揭示了人类早期胚胎发育过程中,父母源基因组的DNA甲基化与染色质状态的不对称分布。另外,研究定量比较了人类和小鼠胚胎的染色质状态,发现物种保守性及特异性的表观遗传学特征。这为今后人们继续研究人鼠两个物种早期胚胎中表观遗传学的异同奠定了理论基础,明确了利用小鼠作为模式生物研究哺乳动物早期发育的优势和局限性。本研究为探究临床上胚胎发育阻滞、着床失败、反复流产等问题的发生机制及诊治策略提供了新的思路和研究方法。

该研究在国际上率先开发了对同一个单细胞可以同时研究其染色质状态、核小体定位、DNA
甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性 5
个层面的单细胞多组学测序技术,并首次利用该技术对小鼠着床前胚胎发育的 7
个关键阶段进行了全基因组水平、单细胞分辨率、单碱基精度的表观基因组研究,并深度解析了父母源基因组在着床前胚胎发育中
DNA
甲基化和染色质状态的重编程过程。该研究系统地描绘了高度特化的配子在受精后重编程到具有发育全能性的受精卵、以及进一步发育成多能性胚胎的过程中,
DNA
甲基化和染色质状态发生的精准、有序的变化,以及各个组学层面之间的互动关系。该工作为今后人们继续研究哺乳动物早期胚胎细胞全能性和多能性的开启奠定了基础,同时为体细胞克隆效率的提高以及早期胚胎发育异常的诊断与治疗提供了新思路。

北京大学第三医院博士生任一昕、北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心博士生李琳和高云,以及四川大学郭帆研究员为该论文的并列第一作者;北医三院乔杰和北京大学生命学院汤富酬为该论文的共同通讯作者。该项研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、北京市科学技术委员会、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北大-清华生命科学联合中心(CLS)等的资助。

北京大学生命科学学院 BIOPIC
中心的博士后郭帆博士、博士生李琳、李静云为该论文的并列第一作者;北京大学生命科学学院汤富酬研究员和四川大学郭帆研究员为这篇文章的共同通讯作者。该研究工作由北京大学和四川大学共同合作完成,并且得到了国家自然科学基金委员会、北京未来基因诊断高精尖创新中心,以及北大

参考文献:

  • 清华联合中心的资助。

Yan, L., Yang, M., Guo, H., Yang, L., Wu, J., Li, R., Liu, P., Lian, Y.,
Zheng, X., Yan, J., et al. (2013). Single-cell RNA-Seq profiling of
human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol
Biol
20, 1131-1139.

Guo, H., Zhu, P., Yan, L., Li, R., Hu, B., Lian, Y., Yan, J., Ren, X.,
Lin, S., Li, J., et al. (2014). The DNA methylation landscape of human
early embryos. Nature 511, 606-610.

Zhu, P., Guo, H., Ren, Y., Hou, Y., Dong, J., Li, R., Lian, Y., Fan, X.,
Hu, B., Gao, Y., et al. (2018). Single-cell DNA methylome sequencing of
human preimplantation embryos. Nature genetics.

责编:白杨

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